■本報記者 韓揚眉

剪切、復制、粘貼，消除不需要的基因片段，換上想要的基因片段，這就是基因組編輯技術(shù)。這把“基因剪刀”被科學(xué)家應用在各種動(dòng)植物的基因修復與改造中，為醫學(xué)、健康、農業(yè)等帶來(lái)了突破性革命。

為了更精準地實(shí)現基因組編輯，近年來(lái)，科學(xué)家不斷探索更多方法發(fā)展基因組編輯技術(shù)。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究員高彩霞團隊與中國科學(xué)院院士李家洋團隊合作開(kāi)發(fā)了高效設計pegRNA，以及提高植物引導編輯效率的新策略，為實(shí)現植物基因組功能解析和作物精準育種提供了強有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果近日在線(xiàn)發(fā)表于《自然—生物技術(shù)》。

更精準的“夢(mèng)想”

2019年10月，美國哈佛大學(xué)教授劉如謙團隊開(kāi)發(fā)了全新的基因組引導編輯技術(shù)（Prime Editing）。該技術(shù)能夠在基因組的靶位點(diǎn)處實(shí)現片段的精準插入、刪除及堿基的任意替換，被稱(chēng)為是“超越CRISPR”的重大突破。

引導編輯系統由兩部分構成：一是nCas9（H840A）與工程化改造的逆轉錄酶（RT）組成的融合蛋白；二是包含PBS序列和RT模板序列的pegRNA。

2020年，高彩霞團隊擴展了引導編輯技術(shù)的應用，首次在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導編輯器（PPE），為實(shí)現農作物精準基因組編輯提供了技術(shù)支撐。

“目前的引導編輯器在植物中的工作效率依舊偏低，需要進(jìn)一步優(yōu)化?！备卟氏几嬖V《中國科學(xué)報》，“我們之前的研究發(fā)現植物引導編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響，這暗示著(zhù)對pegRNA序列進(jìn)行合理設計有助提高引導編輯效率?！?/p>

兩種新策略

如何提升引導編輯效率并快速獲取高效形式的pegRNA，是植物引導編輯技術(shù)亟須解決的問(wèn)題。

一開(kāi)始，研究人員篩選了高效形式的pegRNA，并希望能找到一般性規律。 然而，事與愿違。常規實(shí)驗方法費時(shí)費力，限制了引導編輯技術(shù)在植物中的應用。

于是，研究人員另辟新路。

由于引導編輯系統的PBS序列與非靶標鏈結合是起始逆轉錄過(guò)程的重要條件，而熔解溫度（Tm）決定了兩條鏈結合的緊密程度，因此他們推測PBS的Tm值有可能對引導系統的編輯效率有重要影響。

為驗證推測，研究人員在18個(gè)內源位點(diǎn)進(jìn)行了測試。結果表明，當PBS的Tm值為30℃左右時(shí)，引導編輯效率在多數水稻內源位點(diǎn)上達到最高，并且隨著(zhù)溫度的增高或降低均呈現遞減的趨勢。這也驗證了他們的猜想。

研究人員還設想，為一個(gè)DNA位點(diǎn)的正鏈和負鏈各設計一個(gè)pegRNA，利用DNA兩條鏈之間存在的反向互補序列，同時(shí)“啟動(dòng)”細胞中的其他修復途徑，共同提高引導編輯系統效率。

他們在15個(gè)水稻內源位點(diǎn)測試了該策略。結果表明，該策略與分別遞送單個(gè)pegRNA方法相比效率平均可以提升3倍。他們將該改進(jìn)策略命名為“雙pegRNA策略”。

另外，實(shí)驗還表明，運用SpG變體可以進(jìn)一步拓展雙pegRNA策略的編輯范圍。

建立新平臺

對于這一成果，國際同行專(zhuān)家給出了高度評價(jià)：“鑒于引導編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，該工作將對基因組編輯領(lǐng)域產(chǎn)生很大影響?！?/p>

“pegRNA的設計相對復雜。如何建立一個(gè)平臺，幫助科研人員針對所需位點(diǎn)進(jìn)行合理的設計，并構建高效的引導編輯策略，以方便大家使用，在這方面李家洋團隊非常有經(jīng)驗?！备卟氏颊f(shuō)。

為此，基于上述兩個(gè)策略，研究人員開(kāi)發(fā)了植物pegRNA設計網(wǎng)站PlantPegDesigner。

該網(wǎng)站可以提供一系列參數供使用者根據需要進(jìn)行個(gè)性化選擇，并可以推薦完整的pegRNA選擇、設計與構建方案，方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實(shí)驗結果表明，與常規設計方案或其他pegRNA設計網(wǎng)站相比，該網(wǎng)站設計的pegRNA具有更高的編輯效率。

專(zhuān)家指出，實(shí)現重要農作物精準基因組編輯對加快農作物遺傳改良進(jìn)程具有重要意義。下一步，研究團隊將繼續優(yōu)化策略，提升網(wǎng)站平臺，為作物品種改良等提供更高效、精準的新工具。

相關(guān)論文信息：

https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w